CaCo-2細(xì)胞模型法

CaCo-2細(xì)胞模型法評價SNAC對Semaglutide腸吸收影響的實驗

方案草案

1、CaCo-2 細(xì)胞模型簡介

CaCo-2細(xì)胞系人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(the human colonadenocarcinoma cell line)是一種結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞，具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相同的酶系統(tǒng)，也具有小腸上皮類似的胞飲功能，可以用來進(jìn)行模擬體內(nèi)腸轉(zhuǎn)運(yùn)的實驗。在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，CaCo-2細(xì)胞生長在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上的細(xì)胞可融合并分化為類腸上皮細(xì)胞，形成連續(xù)的單層。

2、CaCo-2 細(xì)胞模型的運(yùn)用

現(xiàn)代藥物研發(fā)成功與否，與藥物的代謝特性密切相關(guān)。人工合成和篩選的化合物已被大規(guī)模的高通量篩選所取代，無論是開發(fā)新藥還是開發(fā)新的給藥途徑，化合物在體內(nèi)的吸收特性都具有突出的地位。以往傳統(tǒng)的體內(nèi)藥代吸收篩選模型，由于所需藥物量大、難以批量化、耗時長以及費(fèi)用高等弊端，已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代新藥的研發(fā)要求，因而開發(fā)新的快速、準(zhǔn)確以及需藥量少的藥物吸收篩選模型已成為新藥研發(fā)的必然趨勢。被廣泛采用的三種篩選方法是：大鼠原位單次灌注法、大鼠外翻腸囊法以及CaCo-2細(xì)胞模型法。其中，CaCo-2細(xì)胞模型法已經(jīng)成為一種預(yù)測藥物人體小腸吸收以及研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)體外篩選工具。

人類小腸上皮中的各種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、代謝酶等在CaCo-2細(xì)胞中也有相同的表達(dá)，如細(xì)胞色素P450同工酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶、葡萄糖醛酸酶。同時糖、氨基酸、二肽、維生素等多種主動轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在CaCo-2細(xì)胞中都有與小腸上皮細(xì)胞類似的表達(dá)，非常接近藥物在人體內(nèi)吸收的實際環(huán)境。

小腸上皮的代謝、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、p-gP對藥物分子的泵出，均為酶學(xué)飽和的動力學(xué)。聯(lián)合用藥時，因為存在藥物相互競爭的酶、載體或p-gP的作用，所以與單獨(dú)給藥時的生物利用度存在差異，這一相互作用可以通過CaCo-2細(xì)胞模型進(jìn)行研究。尤其近年來發(fā)現(xiàn)p-gP成為藥物吸收的一個重要生化屏障，它把進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，因此成為口服藥物生物利用度低、波動大的一個重要影響因素。CaCo-2細(xì)胞具有p-gP的表達(dá)，非常適合用吸收機(jī)制的深入研究。

3、Semaglutide的口服吸收研究

已有文獻(xiàn)報道，Semaglutide 5mg，SNAC150mg或300mg能顯著增加Semaglutide在胃內(nèi)的吸收，本研究運(yùn)用CaCo-2細(xì)胞模型法探討SNAC是否能夠促進(jìn)Semaglutide在小腸吸收。

3.1研究方法：

3.1.1實驗材料

CO₂培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，冷凍高速離心機(jī)，超凈工作臺，水浴鍋，酶標(biāo)儀，培養(yǎng)皿，凍存管，移液槍，培養(yǎng)基，Transwell等。

3.1.2供試品

Semaglutide原料，由杭州先為達(dá)生物科技有限公司提供，批號：  

SNAC，由成都普康生物科技有限公司提供，批號：   COA見附件。

鵝去氧膽酸，由成都普康生物科技有限公司提供。

3.1.3實驗方法

3.1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)階段

細(xì)胞來源：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（白人，男性，72歲）。常規(guī)方法復(fù)復(fù)蘇細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。接種到Transwell后，于第7、14、21天做堿性磷酸酶活性檢測，判斷CaCo-2細(xì)胞在生長的分化程度；于第7、9、11、13、15、17天檢測CaCo-2 細(xì)胞單層跨膜電阻值(Transepithelial Electrical Resistance，TEER) ，當(dāng) TEER 值穩(wěn)定在500?1500 Ω·cm2 之間時，表明其單層膜達(dá)到致密性，具有轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收功能；在第21天做苯酚紅的通透性實驗，計算表觀滲透系數(shù)，小于1 x 10⁶，即說明單層膜細(xì)胞連接緊密完整性良好。以上驗證完成后即表明Caco-2 細(xì)胞模型的構(gòu)建完成，可作為模擬小腸體外轉(zhuǎn)運(yùn)模型。

3.1.3.2 Semaglutide細(xì)胞毒性試驗

根據(jù)Semaglutide口服制劑規(guī)格，評價Semaglutide  1~20ug/ml濃度范圍內(nèi)，CaCo-2 細(xì)胞存活率，選擇無細(xì)胞毒性濃度區(qū)間進(jìn)行后期實驗。初步估算濃度可選擇2.5ug/ml。

3.1.3.3 SNAC及鵝去氧膽酸細(xì)胞毒性試驗

根據(jù)既往研究經(jīng)驗，SNAC在50ug/ml到200ug/ml之間，細(xì)胞存活率無影響；在200ug/ml到800ug/ml，細(xì)胞存活率顯著下降。初步?jīng)Q定SANC試驗濃度為200ug/ml。

根據(jù)既往研究經(jīng)驗，鵝去氧膽酸試驗濃度為10~15mmol/L

3.1.3.4 SNAC對Semaglutid吸收影響試驗

實驗分組如下：

Transwell上室加藥，下室取樣檢測藥物濃度，每組3復(fù)孔。各組分別于加樣后5min，15min，30min，45min，60min，90min取樣檢測，每次取樣50ul~100ul,并根據(jù)取樣體積補(bǔ)足液體，后期計算分析中計算累積滲透量及滲透率。

取樣后-80℃冰箱保存，干冰郵寄至杭州先為達(dá)生物科技有限公司進(jìn)行檢測，檢測數(shù)據(jù)反饋后計算滲透率。

測試分析方法：略

計算分析：略

4、研究經(jīng)費(fèi)

康寧公司Transwell一板為12孔，做3復(fù)孔可以同時做4個樣品，本實驗室一次細(xì)胞培養(yǎng)可做6板，最多可評價24個樣品，能夠?qū)崿F(xiàn)較大樣品/方案的篩選，為保證質(zhì)量，每次建議做1~4板。結(jié)合多年研究經(jīng)驗，本實驗室按照Transwell板數(shù)量進(jìn)行收費(fèi)。